همسانه سازی ژن گلوتامات دکربوکسیلاز باکتری لاکتو باسیلوس کازئی و ساخت وکتور بیانی آن

گاما آمینو بوتیریک اسید (گابا) یک اسیدآمینه ی غیرپروتئینی است که به عنوان یک ترکیب داروئی مهم در درمان بسیاری از اختلالات عصبی به کار می رود. گابا توسط آنزیم وابسته به plp گلوتامات دکربوکسیلاز gad)) تولید می گردد. این آنزیم در هردو دسته ی باکتری های بیماریزا و همزیست لوله ی گوارش با مصرف پروتون در ایجاد مقاومت اسیدی نقش دارد. لذا همسانه سازی ژن کدکننده ی آنزیم gad از منابع مختلف به منظور مقایسه ی توالی ژنی آن با ژن های gad موجود در سایر موجودات، ساخت ناقل بیانی به منظور خالص سازی و تولید انبوه آنزیم و نیز دستکاری پروتئین به منظور بهبود خواص آن، همگی اقدامات موثری در جهت تولید انبوه محصول ارزشمند گابا می باشند. با توجه به این که آنزیم gad در پاتوژن هایی مانند لیستریا مونوسایتوژنز هم در ایجاد مقاومت اسیدی نقش دارد، در نتیجه پیدا کردن یک ترکیب شبه داروئی با قابلیت مهار فعالسازی آنزیم می تواند راهکار مفیدی در جهت مختل کردن مسیر مقاومت اسیدی در این پاتوژن باشد. در این تحقیق تلاش جهت جداسازی ژن gad از 5 سویه ی باکتری های اسید لاکتیک، لاکتوباسیلوس کازئی زیرگونه ی کازئی ptcc 1608، لاکتوباسیلوس روتری dsm 20016، لاکتوباسیلوس فرمنتوم ptcc 1638، لاکتوباسیلوس دلبروکی زیر-گونه ی دلبروکی ptcc 1333 و لاکتوکوکوس لاکتیس ptcc 1336، صورت گرفت. پس از pcr با آغازگرهای اختصاصی قطعات به دست آمده جهت توالی یابی وارد ناقل همسانه سازی pgem-t گردیدند. پس از توالی یابی قطعات ژنی gad به صورت جداگانه وارد ناقل بیانی pet-32a(+) شدند. ناقل بیانی نوترکیب سپس وارد باکتری اشرشیا کلی سویه ی top10 ،به عنوان میزبان همسانه سازی، گردید. جهت بهبود خواص آنزیم با اعمال جهش نقطه ای به صورت مجازی از آنزیم gada اشرشیا کلی به عنوان پروتئین هدف استفاده شد. ابتدا تأثیر جهش های تک نقطه ای مختلف در سرتا سر پروتئین بر پایداری حرارتی آنزیم توسط وب گاه popmusic 2.1 بررسی شدند. جهش ها ی پایدار کننده به صورت مجازی در نواحی غیرحفاظت شده ی جایگاه فعال آنزیم اعمال شدند. تمایل اتصالی آنزیم به کوفاکتور و سوبسترا در جهش یافته ها و آنزیم اصلی از طریق داک گذاری مولکولی بررسی شد. جهت مهار تشکیل فرم فعال آنزیم gad لیستریا مونوسیتوژنز پس از پیش بینی ساختار سه بعدی پروتئین به صورت مجازی، از طریق غربالگری مجازی تمایل اتصالی 13059 ترکیب شبه داروئی برگرفته از پایگاه داده های zinc به جایگاه دایمریزاسیون آنزیم بررسی شد. نتایج توالی یابی قطعات به دست آمده بیانگر عدم وجود ژن gad در ژنوم باکتری لاکتوباسیلوس کازئی زیرگونه ی کازئی ptcc 1608 بودند. حال آنکه ژن مورد نظر در سایر سویه ها وجود داشت. قطعات ژن gad با موفقیت در ناقل بیانی pet-32a(+) همسانه سازی شدند. ناقل نوترکیب ساخته شده می تواند در مطالعات بعدی جهت تولید انبوه و خالص سازی راحت تر آنزیم به کار رود. در اثر اعمال جهش در جایگاه فعال آنزیم gad اشرشیا کلی مشخص شد در 5 جهش یافته ی d301a، d301t، r395m، s393c و k84t علاوه بر افزایش پایداری حرارتی آنزیم، تمایل اتصالی آن به کوفاکتور و سوبسترا نیز افزایش می یابد. نتایج غربالگری مجازی نشان داد ترکیب شبه داروئی با شماره دسترسی zinc22781062 دارای تمایل اتصالی بالا به جایگاه دایمریزاسیون زیرواحد های آنزیم است. از آنجایی که کوچکترین واحد الیگومری مورد نیاز برای شکل گیری فرم فعال در آمینواسید دکربوکسیلازهایی مانند gad به صورت همودایمر می باشد، لذا پیش بینی می شود ترکیب مذکور با اتصال به جایگاه دایمریزاسیون و ممانعت از اتصال زیرواحد ها به هم می تواند مانع فعال سازی آنزیم شود.